暗場顯微鏡是一種利用傾斜照明來增強樣品在正常照明條件下成像不佳的對比度的技術(shù)。

在直射光被聚光鏡中的不透明光闌遮擋后，從傾斜角度穿過樣品的光線被衍射、折射并反射到顯微鏡物鏡中，以形成疊加在深色背景上的標(biāo)本的明亮圖像。

這種深色背景提供了高對比度，并且可以使具有復(fù)雜背景的標(biāo)本以相對較少的工作量脫穎而出。

暗場顯微鏡如何工作？

暗場照明需要阻擋通常穿過標(biāo)本和標(biāo)本周圍的大部分光線，只允許傾斜光線與標(biāo)本相互作用。

一個簡單的阿貝暗場聚光鏡的頂部透鏡是球形凹面的，允許從頂部透鏡表面出現(xiàn)的光線形成一個倒置的空心錐形光，焦點集中在標(biāo)本平面上。在沒有樣品且聚光鏡的數(shù)值孔徑大于物鏡的地方，傾斜光線會相互交叉并錯過物鏡，使這些區(qū)域變暗。

當(dāng)將標(biāo)本（特別是未染色的、不吸光的標(biāo)本）放在載玻片上時，傾斜光線會與標(biāo)本相互作用，并被樣品中的元素（如細胞膜、細胞核和內(nèi)部細胞器）衍射、反射和/或折射。這允許這些微弱的光線進入物鏡，就能呈現(xiàn)出黑色背景上的明亮標(biāo)本。

暗視野顯微鏡需要哪些組件？

幾乎任何明場實驗室顯微鏡都可以輕松轉(zhuǎn)換以進行暗場照明。簡單的方法是用專為暗場照明設(shè)計的聚光鏡關(guān)閉當(dāng)前的聚光鏡。

這些聚光鏡相對簡單，并提供創(chuàng)建暗場的錐形照明所需的高數(shù)值孔徑（NA）。然而，基于照明類型切換聚光鏡對于日常顯微鏡使用是不切實際的。幸運的是，有一個解決方法。

許多聚光鏡可以容納能產(chǎn)生錐形照明的內(nèi)插件。這些內(nèi)插件的數(shù)值孔徑不能像專用暗場聚光鏡那樣高，因此并非所有物鏡都可以使用。但是，內(nèi)插件使您可以靈活地在同一聚光鏡上使用多種觀察方法。

為什么暗場顯微鏡是一種很好的成像技術(shù)？

一般來說，在適當(dāng)?shù)陌祱稣彰鳁l件下成像的物體非常壯觀。通常，在明場顯微鏡中固有對比度非常低的標(biāo)本在暗場中閃耀出明亮的光芒。

暗場照明適合顯示輪廓、邊緣、邊界和折射率漸變。暗場照明的理想適用對象包括微小的活水生生物、硅藻、小昆蟲、骨骼、纖維、頭發(fā)、未染色的細菌、酵母、組織培養(yǎng)中的細胞和原生動物。

非生物標(biāo)本包括礦物和化學(xué)晶體、膠體顆粒、粉塵計數(shù)標(biāo)本以及含有小夾雜物、孔隙率差異或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片。

不幸的是，暗場照明對于揭示內(nèi)部細節(jié)不太有用。如果您想充分利用暗場照明，還需要考慮其他條件。

使用暗場顯微鏡的挑戰(zhàn)是什么？

在為暗場顯微鏡準(zhǔn)備標(biāo)本時要小心，因為位于焦點平面上方和下方的特征會散射光并導(dǎo)致圖像退化。在成像時，載玻片的清潔度是一個重要因素，但在暗場中更為重要，因為每一塊碎片都會被照亮，并可能帶走您想要看到的東西。

在設(shè)置暗場顯微鏡時，您可能面臨的其他挑戰(zhàn)包括：

·照明不足以使標(biāo)本可見，或者試樣可見但非常微弱。

暗場顯微鏡需要大量的光線才能正確成像，因為其中很多光線都被阻擋以形成錐體。因此，不要猶豫，打開電源，但請注意，有些樣品可能不喜歡長時間照在它們上面的光量。

·載玻片在視野中心有一個黑點，但外圍的物體照明良好，看起來正常。

這通常是在聚光鏡未正確對準(zhǔn)或聚焦時引起的。對聚光鏡進行對中和聚焦能解決這個問題。這個操作適用于照明不均勻但樣品在焦點處的大多數(shù)問題。

·顏色顯示在背景中，或者背景不均勻地亮起，并帶有灰色色偏。

這通常是由于樣品太厚或安裝在受污染的介質(zhì)中造成的。重新裝入樣品應(yīng)該會有所幫助。

使用暗場顯微鏡的優(yōu)勢是什么？

暗視野顯微鏡具有許多優(yōu)點。其深色背景提供了高對比度，可以很容易地在復(fù)雜的背景上看到標(biāo)本。這種技術(shù)很容易實現(xiàn)，因為許多明場實驗室顯微鏡可以配置為暗場照明。除了顯微鏡的好處之外，暗場圖像甚至可以看起來像藝術(shù)品，樣品被精美地照亮。